دور البلازميدات في انتاج البلو ارت البروتينية في بكتريا Bacillus thuringiensis المعزولة محليا

دور البلازميدات في انتاج البلو ارت البروتينية في بكتريا Bacillus thuringiensis المعزولة محليا * محمد عادل P جعفر P عبد الكريم عبد الر ازق الق ازز و علي صادق محمد قسم التقنيات الاحياي ية كلية العلوم جامعة بغداد,بغداد,الع ارق. الخلاصة درست قابلية العزلة المحلية Bacillus thuringiensis على انتاج البلو ارت البروتينية وذلك بفحصها مجهريا وتبين قدرتها على انتاج البلو ارت البروتينية بعد الترحيل الكهرباي ي في هلام الاكاروز بتركيز 48 ساعة من بداية النمو. درس النمط البلازميدي با ستخدام تقنية %0.7 وتبين امتلاكها حزمة بلازميدية واحدة كبيرة ذات وزن جزيي ي كبير درس دور الحزمة البلازميدية في انتاج البلو ارت البروتينية من خلال تجارب الاقت ارن التي اجريت على العزلة.B thuringiensis المنتجة للبلو ارت البروتينية و الحساسة لمضاد الريفاميسين المستخدمة كخلايا واهبة والعزلة spp. Bacillus غير المنتجة للبلو ارت البروتينية والمقاومة لمضاد الريفاميسين التي اعتبرت خلايا مستلمة. اظهرت نتاي ج الاقت ارن الحصول على مستعم ارت مقترنة على وسط الاكار المغذي الحاوي على مضاد الريفاميسين وقادرة على انتاج البلو ارت البروتينية مما يشير الى دور البلازميد في انتاج هذه الصفة وهذا ما اكدته د ارسة النسق البلازميدي لكل من الخلايا الواهبة والمستلمة والمقترنة. Plasmid Role in Crystals Protein Production in Locally Isolated Bacillus Thuringiensis Mohammad Adil Jaafar*, Abdul Kareem Al-Kazaz and Ali Sadiq Mohammad Department of Biotechnology, Collage of Science, University of Baghdad, Baghdad,Iraq. Abstract The ability of crystals protein production was studied in local isolate Bacillus thuringiensis by microscope examination, and the crystals protein production were seen after 48 hour from growth starting, the study of plasmid profile of the isolate using gel electrophoresis technique in 0.7% of agaros gel, revealed that it had one Mega plasmid band, the plasmid role in production of crystals protein was studied by using conjugation *Email:mohammad_biotechnology2@yahoo.com 301

experiments, that they applied on the local isolate B. thuringiensis which was crystals protein producer and Rifamycin sensitive as donor cells, with Bacillus spp. which didn t produce crystals protein and Rifamycin resistance as recipient cells. Conjugation experiments assured the transmission of crystals production trait with Plasmid to the recipient cells, this result confirmed that crystals protein trait was Plasmid bourn. البحث مستل من رسالة الماجستير للباحث الاول. المقدمة لاتختلف بكتريا.B thuringiensis عن بقية انواع جنس الBacillus فهي موجبة لصبغة غ ارم عصوية الشكل مكونة للا بواغ ماعدا قابليتها على انتاج البلو ارت البروتينية او ما يعرف بالذيفان الداخلي endotoxin) (cry خلال مرحلة تكوين الابواغ [1] والتي تكون مسؤولة عن صفة السمية للحش ارت ونتيجة لا متلاكها هذه الخاصية ركزت البحوث حول هذا النوع البكتيري لا جل استخدامها في مجال السيطرة البايلوجية بوصفها مبيدا للا فات الز ارعية. اذ اصبحت تمثل %90 من المبيدات الحشرية المستخدمة في الولايات المتحدة الامريكية نظ ار لعدم وجود اي تا ثير سام لها على الخلايا الحيوانية ] 2,3] وفي السنين الاخيرة برزت بحوث حول قدرة البلو ارت البروتينية المنتجة من سلالات مختلفة من بكتريا.B thuringiensis على القتل التفضيلي للخلايا السرطانية ] 4,5] كما امكن نقل صفة قتل الحش ارت الى النبات عن طريق اقحام الجينات المشفرة للذيفان الداخلي في المجين النباتي عن طريق بكتريا Agarobacterium. [6,7 ] tumefaciens تمتلك غالبية الانماط المصلية العاي دة لبكتريا.B thuringiensis عوامل خارج كروموسومية تختلف با عدادها و او ازنها الجزيي ية من نمط منصلي لا خر. ان الصفة المشتركة بين الانماط المصلية لبكتريا.B thuringiensis هي وجود ترتيب بلازميدي معقد اذ يكون الاختلاف في عدد و حجم تلك البلازميدات فيكون التغاير كبير بالوزن الجزيي ي ) 1.4-180) [8] MD و كذلك عددها فيت اروح بين 1 8 اذ اشارت د ارسة الى امتلاك تحت النوع subsp..b thuringiensis israelensis نسق بلازميدي معقد من ثمانية بلازميدات با و ازن جزيي ية مختلفة هي 75 68 10.6 4.9 4.2 3.3 [9] MD 135 105 ويمكن ان يكون اكثر من ثمانية بلازميدات [4] ان العديد من الجينات المشفرة للبلو ارت البروتينية تكون بلازميدية المنشا كما ان بعضها كروموسومية المنشا. وتكون هذه الجينات محمولة على بلازميدات كبيرة 40 MD150 وبالتالي فا ن غالبية هذه البلازميدات هي بلازميدات اقت ارنية Plasmids) (Conjugative [10] تستطيع البلازميدات الحاملة للجينات المشفرة لهذه الصفة تحت الظروف المختبرية الانتقال بين و ضمن الانواع البكتيرية Bacillus thuringiensis Bacillus Bacillus cereus Bacillus anthracis [11,12,13] megaterium اذ اشار ] 14] الى ان تردد انتقال هذه الجينات الكروموسومية المنشا في تجارب الاقت ارن يكون واطي بينما يكون أعلى في الجينات البلازميدية المنشا تهدف الد ارسة الى اثبات دور البلازميدات في انتاج البلو ارت البروتينية عن طريق اج ارء تجارب الاقت ارن. المواد و ط اري ق العمل 1- العزلات البكتيرية استخدمت العزلة المحلية.B thuringiensis المعزولة من د ارسة سابقة ] 15] المنتجة للبلو ارت البروتينية والحساسة لمضادRifamycin في حين استخدمت العزلة المحلية Bacillus. غير المنتجة للبلو ارت البروتينية والمقاومة للRifamycin spp. 2- فحص انتاج البلو ارت البروتينية تم الفحص المجهري لقابلية انتاج البلو ارت البروتينية بعد اتباع طريقة التصبيغ الموصوفة من قبل [16]. 3- اختبار الحساسية تجاه المضادات الحياتية تم اج ارء الفحص بطريقة الاق ارص (Agar disk diffusion medium) ] 17] لغرض اختبار حساسية بكتريا B.thuringiensisتجاه عدد من مضادات الحيوية التالية Streptomycin Carbancillin Rifamycin Nalidixic acid Ampicillin Tetracycllin. Erythromycin 4- عزل الدنا البلازميدي تم استخلاص الدنا الكلي من الخلايا البكتيرية بطريقة التمليح الخارجي out) (Salting الموصوفة من قبل [18]. 5- الترحيل الكهرباي ي حدد المحتوى البلازميدي للعزلات البكتيرية بعد ترحيل المحتوى الو ارثي المستخلص على هلام الاكاروز بتركيز %0.7 وحسب الطريقة الموصوفة من قبل [18]. 302

6- عزل بكتريا spp. Bacillus المقاومة لمضاد Rifamycin نميت الخلايا البكتيرية على وسط الاكار المغذي بت اركيز متدرجة من مضاد Rifamycin ابتدأ من 0.25 الى 50 مايكروغ ارم/مليليتر حسب ما ذكر في [13]. 7- الاقت ارن البكتيري اجريت تجربة الاقت ارن بين بكتريا.B thuringiensis المنتجة للبلو ارت البروتينية و الحساسة لمضاد اليفمايسين كخلايا واهبة و البكتريا المستلمة spp. Bacillus غير المنتجة للبلو ارت البروتينية والحساسة لمضاد الريفاميسين حسب ما جاء في ] 19] وبعد عملية الاقت ارن تم نشر عينات بمقدار 0.1 مليليتر بعد اج ارء التخافيف على وسط الاكار المغذي الحاوي على مضاد الريفاميسين بتركيز نهاي ي 50 مايكرو غ ارم/مليليتر وحضنت الاطباق بدرجة 37 مي وي لمدة 48 ساعة بعدها تم فحص قدرة المستعم ارت النامية على انتاج البلو ارت البروتينية مجهريا. يعودان الى مجموعة البنسلينات اذ اشارت د ارسات عدة الى ان صفة المقاومة للبنسلين هي احدى الصفات التشخيصية لبكتريا.B thuringiensis و بكتريا.B cereus والتي تميزها عن بكتريا.B anthracis وهذه الصفة ناتجة من قابلية البكتريا على انتاج انزيم.[21,22] β-lactamase عزل الدنا البلازميدي تم التحري عن المحتوى الو ارثي لبكتريا.B thuringiensis وذلك لا جل التعرف على النسق البلازميدي اذ تم اعتماد طريقة التمليح الخارجي ] 18] لعزل الدنا الكلي والتي اظهرت كفاءة في عزل الدنا البلازميدي. S للبلو ارت.B thuringiensis النتاي ج و المناقشة فحص انتاج البلو ارت البروتينية لغرض فحص انتاجية بكتريا البروتينية اتبعت طريقة التصبيغ الموصوفة من قبل ] 16] والشكل Carbol fuchsin بالون 1 يوضح تلون الابواغ البكتيرية بصبغة الاحمر والتي تكون بيضوية الشكل في حين اصطبغت البلو ارت البروتينية بصبغة Naphthul blue black بالون الاسود. الحساسية تجاه مضادات الحيوية.B thuringiensis على مقاومة تم اختبار قابلية بكتريا عدد من مضادات الحيوية باستخدام طريقة الاق ارص Agar disk diffusion حيث تم اختبار سبعة انواع من مضادات الحيوية توزعت حسب اختلافها في اليات تا ثيرها على الخلية البكتيرية.B thuringiensis كانت [20]. بينت النتاي ج على ان بكتريا Streptomycin Rifamycin للمضادات الحيوية حساسة Erythromycin Nalidixic acid Tetracycllin في حين Carbancillin واللذان Ampicillin و كانت مقاومة للمضادين الشكل 1- البلو ارت البروتينية والابواغ العاي دة لبكترياthuringiensis B بعد تصبغها بصبغتي Carbol fuchsin و Naphthul ( S= Spore, C= Crystal) blue black أكدت نتاي ج الترحيل الكهرباي ي في هلام الاكاروز وبعد مرور ساعة ونصف من بدء الترحيل امتلاك بكتريا.B thuringiensis حزمة بلازميدية واحدة كبيرة في حين تبين عدم امتلاك بكتريا. spp Bacillus اي حزمة بلازميدية والشكل 2 يوضح نتاي ج الترحيل الكهرباي ي أشارت د ارسات عدة الى امتلاك سلالات بكتريا.B thuringiensis نسق بلازميدي معقد فيكون متغاير بالعدد والوزن الجزيي ي فقد اشار[ عاي دة الى تحت النوع kurstaki قد يصل الى [23 12 وبا و ازن جزيي ية ترواحت C في د ارسة على سلالات امتلاكها عدد من البلازميدات. MD 120 1.9 303

وفي د ارسة اخرى اجريت من قبل ] 9] على تحت النوع.B thuringiensis subsp. israelensis تبين امتلاكها 8 بلازميدات و با و ازن جزيي ية ترواحت 3.3 135.MD وكما تشير هذه الد ارسات الى وجود اختلاف في العدد و الوزن الجزيي ي للبلازميدات المعزولة من سلالات عاي دة لنفس تحت النوع العاي د لبكتريا.B thuringiensis مختبريا وهذا يعود الى استخدام ط اري ق مختلفة عند عزل البلازميدات الكبيرة او بسبب عدم كفاءة ط اري ق العزل لكبر الوزن الجزيي ي لهذه البلازميدات وكذلك قلة عدد النسخ للبلازميدات الكبيرة [13]. 1 2 3 مضاد المقاومة لتركيز Rifamycin في حين عدت بكتريا 50 مايكروغ ارم/مليلتر من مضاد Bacillus spp. Rifamycin بوصفها بكتريا مستلمة لعدم قدرتها على انتاج البلو ارت البروتينية وعدم امتلاكها أية حزمة بلازميدية كما موضح في الشكل. 2 أظهرت النتاي ج الموضحة في الشكل بعد محاولات عدة وبتردد اقت ارن 3 نجاح عملية الاقت ارن -8 (1.2 10P P) اذ اكتسبت البكتريا المستلمة صفة انتاج البلو ارت البروتينية عند فحصها مجهريا وهذا يؤكد أن هذه الصفة بلازميدية المنشا وذلك بعد التحري عن النسق البلازميدي للخلايا المقترنة كما موضح بالشكل 2 الذي يبين انتقال الحزمة البلازميدية الى البكتريا المستلمة المقاومة لمضاد Rifamycin وهذا يؤدي الى الاستنتاج الى ان الجينات التنظيمية والتركيبية المسؤولة عن التشفير لصفة انتاج البلو ارت البروتينية جميعها بلازميدية المنشا وهذه النتاي ج تتفق مع نتاي ج سابقة اكدت انتقال صفة انتاج البلو ارت البروتينية الى انواع اخرى عاي دة الى جنس ال [11,12,13]. Bacillus Mega Plasmid band Chromosomal band RNA S C الشكل - 3 قدرة بكتريا spp. Bacillus المقترنة على انتاج البلو ارت البروتينية عند فحصها بالمجهر الضوي ي بقوة تكبير 200X (S=Spore, C=Crystal) ان نتاي ج تجربة الاقت ارن تتفق مع العديد من الد ارسات التي اشارت الى ان الجينات المشفرة للبلو ارت البروتينية بلازميدية المنشا وتتصف هذه البلازميدات بكونها تمتلك او ازن جزيي ية كبيرة 33 MD150 [10,24] وكذلك كونها بلازميدات اقت ارنية فقد الشكل. 2 -الترحيل الكهرباي ي على هلام الاكاروز بتركيز %0.7 بعد 1.5 ساعة و بفرق جهد 70 فولت بعد اج ارء تجربة الاقت ارن المسار رقم 1 : النسق البلازميدي لبكتريا.B ) thuringiensis الواهبة) قبل الاقت ارن المسار رقم : 2 النسق البلازميدي لبكتريا spp. Bacillus (المستلمة) قبل الاقت ارن المسار رقم : 3 النسق البلازميدي لبكتريا.Bacillus spp (المقترنة) الاقت ارن البكتيري لغرض التعرف على موقع المورثات المشفرة لصفة انتاج البلو ارت البروتينية اجريت تجربة الاقت ارن اذ عدت بكتريا.B thuringiensis بكتريا واهبة لقدرتها على انتاج البلو ارت البروتينية وامتلاكها حزمة بلازميدية فضلا عن حساسيتها اتجاه 304

7. Gatehouse, J.A. 2008. Biotechnological prospect for engineering insect- resistant plant. Plant Physiolo. 146,pp:881-887. 8. Stahly, D.P.,Dingman, D. w.; Bulla, L. A.; and Aronson, A. I. 1978. Possible origin and function of the parasporal crystal in Bacillus thuringiensis. Biochem. and Biophysic. Research Communi. 84,pp: 581-588. 9. Gonzalez, J.M. and Carlton, B.C. 1984. A large transmissable plasmid is required for crystal toxin production Bacillus thuringiensis varity israelensis. Plasmid 11,pp: 28-38. 10. Gonzalez, J.M.; Brown, J. and Carlton, B.C. 1982. Transfer of Bacillus thuringiensis plasmid coding for δ - endotoxin among strains Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 79,pp: 6951-6955. 11. Battisti, L.; Green, B. D. and Thoren, C. B. 1985. Mating system for transfer of plasmids among Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis, J. Bacteriolo. 162,pp:543-550. 12. Wiwat, C.; Panbangred, W. and Bhumiratana, A. 1990. Transfer of plasmids and chromosomal genes amongst subspecies of Bacillus thuringiensis. J. Indust. Microbiolo. 6,pp:19-27. 13. Bora, R. S.; Murty, M. G. and Sekar, V. 1994. Introduction of a lepidopteran specific Insecticidal crystal protein gene of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki by conjugal transfer into a Bacillus megaterium strain that persists in the cotton phyllosphere. Appl. Environ. Microbiolo. 60,pp:214-222. 14. Aronson, A. I. and Beckman, W. 1987. Transfer of chromosomal genes and plasmid in Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiolo. 53,pp: 1525-1530. 15. Al-Rubaie, A. D. J. 2006. Biological and Biochemical Study on parasporal protein produced by Bacillus thuringiensis local isolates (Al-Nahrain University). Ph. D. thesis. 16. Smirnoff, W. A. 1962. A staining method for differentiating spores, crystals and cells of Bacillus thuringiensis. J. Insect. Patholo. 4,pp: 384-386. B اشارت العديد من الادبيات العلمية الى امكانية نقل صفة انتاج البلو ارت البروتينية بوساطة الاقت ارن مختبريا من بكتريا thuringiensis الى عدد من الانواع العاي دة الى جنس ال Bacillus اذ تم نقل صفة انتاج البلو ارت البروتينية من بكتريا الى بكتريا.B megaterium مختبريا من B B. thringiensis خلال عملية الاقت ارن [13] و الى انواع اخرى عاي د ة الى جنس B. subtilis, B. licheniformi تضمنت Bacillus.[10,25] B. cereus sphaericus المصادر: 1. Agaisse, H. and Lereclus, D. 1995. How does Bacillus thuringiensis produce so mach insecticidal crystal protein?. J. Bacterio. 177,pp:6027-6032. 2. Environmental Protection Agency (EPA). 1998. EPA. Reregistration Eligibility Decision (RED) Bacillus thuringiensis US.EPA, preventation pesticides and toxic substance, EPA 738-R-98-004, 19P. 3. Roh, J.Y.; Choi, J.Y., Li,MS; Jin, B.R. Je, YH. 2007. Bacillus thuringiensis as aspecific, safe, and effective toolfor insect pest control. Journal of microbiology and biotechnology 17,pp:547-559. 4. Mizuki, E.; Ohba, M.; Akao, T.; Yamashita, S.; Saitoh, H. and Park, Y.S. 1999. Unique activity associated with non-insecticidal Bacillus thuringiensis parasporal inclusions: in vitro cell- killing action on human cancer cells J. Appl. Microbiolo. 86,pp:477-486. 5. Saitoh, H.; Shiro, O.; Tomoyuki, I.; Tetsuyuki, A.; Mizuki, E. and Ohba, M. 2006. Investigation of a novel Bacillus thuringiensis gene encoding a parasporal protein, parasporin 4, that preferential kills human leukemik T cells. Biosci. Biotechnol. Biochem. 70,pp:2935-2941. 6. Barton, K.; Whiteley, H. and Yang, N. 1987. Bacillus thuringiensis Delta-Endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to Lepidopteran insects. Plant physiolo. 85,pp:1103-1109. 305

P ed. P ed. جعفر واخرون 17. Baron, E. J.; Peterson, L. R. and Finegold, S. M. 1994. Antimicrobial agent and chemotherapy. In: Baily and Scott's th Diagnostic Microbiology.9P Mosby Year Book Inc, USA. 18. Maniatis, T.; Fritsch, E. F. and Sambrook, J. 1982. Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. 19. Weiserova, M. ; HuBacek, J.; Brenner, V.; Piruzian,E.S.;Kobec,N.S.and Velikodvorskaya 1987. Mini-Mu. Transposition bacterial gene on the transmissible plasmid. Folia Microbiology 32,pp: 268. 20. Nester, E. W.; Anderson, D. G.; Roberts, C. E.; Pearsall. N. N. and Nester, M. T. (2001). Antimicrobial medications In : Microbiology, rd A Human Perspective. 3P Pp:495-520. McGrow Hill Higher Companies. 21. Parry, J. M.; Turnbull, P. C. and Gibson, J. R. 1983. Method and characterization test In: A colour atlas of Bacillus sp. wolf medical Publication. Ltd. 22. Turnbull, C. B.; Sirianni, N. M.; LeBron, C. I.; Samaan, M. N.; Sutton, F. N.; Reyes, A. E. and Peruski, L. F. 2004. MICs of selected antibiotecs for Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, and Bacillus mycoides from rangs clinical and environmental source as determined by the Etest. J. Clinic. Microbio. 42,pp:3626-3643. 23. Aronson, A. I.; Beckman, W. and Dunn, P. 1986. Bacillus thuringiensis and related insect pathogens. Microbiolo. Rev. 50,pp:1-24. 24. Kronsted, J. W.; Shnepff, H. E. and Whiteley, H. R. 1983. Diversity of location for Bacillus thuringiensis crystal protein genes. J. Bacteriolo. 154,pp:419-428. 25. Wilcks, A.; Jayaswal, N.; Lereclus, D. and Andrup, L. 1998. Characterization of plasmid paw63, a second self-transmissible plasmid in Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD73. Microbio. 144,pp:1263-1270. 306